細(xì)胞培養(yǎng)操作中，細(xì)胞計(jì)數(shù)是不可或缺的操作，那樣細(xì)胞計(jì)數(shù)該怎么操作呢？
1，Z先備好細(xì)胞計(jì)數(shù)器(血球計(jì)數(shù)板)
應(yīng)用70%酒精將蓋玻片和細(xì)胞計(jì)數(shù)板清理、晾曬預(yù)留。
將曬干的蓋玻片輕輕地遮蓋至血細(xì)胞計(jì)數(shù)機(jī)中。
(注：使用時(shí)須確保蓋玻片和計(jì)數(shù)板已充足晾曬，否則就會(huì)危害后面細(xì)胞充池及計(jì)數(shù)結(jié)論。)
2，制取細(xì)胞懸浮液
針對(duì)貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，我們應(yīng)該Z先應(yīng)用胰酶消化方式使細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)皿表層掉下來。(飄浮細(xì)胞也無需消化吸收，稀釋液到適宜倍率就可以。)
然后加入適度的含血清蛋白培養(yǎng)液，中合胰水解作用并舉懸細(xì)胞，以獲得勻質(zhì)的細(xì)胞懸浮液。規(guī)定盡量將細(xì)胞飄散，不必殘余一切細(xì)胞團(tuán)，但不能用勁太大。
(注：消化吸收過于或消化吸收不完整均會(huì)讓計(jì)數(shù)結(jié)論造成誤差。)
臺(tái)盼蘭染色(可選擇)：
必要時(shí)測(cè)算細(xì)胞的活動(dòng)力，就需要將細(xì)胞懸浮液和0.4%臺(tái)盼蘭等體積混合;
室內(nèi)溫度孵化3-5min(飄浮細(xì)胞染色時(shí)長(zhǎng)可視性狀況適當(dāng)增加)，使臺(tái)盼蘭徹底進(jìn)到死細(xì)胞，使死細(xì)胞著深藍(lán)色。
3，血細(xì)胞計(jì)數(shù)器加樣
應(yīng)用塑料吸管或加樣器將細(xì)胞懸浮液或細(xì)胞/臺(tái)盼蘭混合物滴入到計(jì)數(shù)池邊沿。這時(shí)液體將于虹吸式的影響下進(jìn)到蓋玻片下方計(jì)數(shù)池，此即是充池。
(注：如要開展好幾個(gè)樣品計(jì)數(shù)，應(yīng)盡量保持每一次充池容積一致，一般在10μl/池上下。)
用同樣的方式為另一側(cè)的計(jì)數(shù)池里也加入了計(jì)數(shù)試品。
將計(jì)數(shù)板靜放數(shù)分鐘使細(xì)胞蔓延、地基沉降。
4，細(xì)胞計(jì)數(shù)
在100倍高倍顯微鏡，挪動(dòng)計(jì)數(shù)板將視線指向計(jì)數(shù)板中間大方塊，該格子四周有一圈3條直線包圍著，中間是集中的網(wǎng)格圖。中間格子區(qū)類似正好可以鋪滿全部視線(下面的圖標(biāo)識(shí)的3號(hào)部位)。
各自計(jì)數(shù)大方格1.2.4.5里的細(xì)胞數(shù)。(為了降低計(jì)數(shù)偏差，Z好把細(xì)胞濃度值調(diào)整至20-50個(gè)/大方格。)并重復(fù)記錄另一側(cè)計(jì)數(shù)池里的細(xì)胞數(shù)，累計(jì)8個(gè)大方塊，隨后取平均值。
計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)為：“數(shù)中不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右”。(判定標(biāo)準(zhǔn)為是不是觸碰三條邊框線的分隔線)
假如有好幾個(gè)細(xì)胞并沒有飄散而結(jié)團(tuán)存有，這時(shí)只能記作一個(gè)細(xì)胞。假如包塊許多，則需要再次吹打乃至再次抽樣消化吸收直到絕大部分細(xì)胞為單獨(dú)細(xì)胞。
5，細(xì)胞濃度值
每一個(gè)大方格的容量為：
1 mm2×0.1 mm=0.1 mm3=10-4 cm3=10-4 ml
即每一個(gè)大方格的容量為萬分之一mL，因而在預(yù)估每毫升液態(tài)里的細(xì)胞數(shù)時(shí)要乘于104。
在普通未使用臺(tái)盼蘭染色時(shí)，可以通過下邊公式換算每毫升樣本中細(xì)胞的數(shù)量：
每毫升樣本中細(xì)胞的數(shù)量=每一個(gè)大方格內(nèi)細(xì)胞的平均值 × 細(xì)胞稀釋倍數(shù)×104
如果采用了臺(tái)盼蘭染色，還要測(cè)算活細(xì)胞的百分比：
活細(xì)胞百分比(%)=臺(tái)盼蘭拒染細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100
這時(shí)活細(xì)胞數(shù)字的計(jì)算公式：
每毫升樣本中活細(xì)胞的數(shù)量=每一個(gè)大方格中細(xì)胞的平均值×活細(xì)胞比例×細(xì)胞稀釋倍數(shù)×2×104
注：乘2主要是因?yàn)樵谂_(tái)盼蘭染色時(shí)，展開了等體積混合，等同于稀釋液了一倍。
看過之**程和機(jī)理，大伙兒禁不住要問：為什么一定要數(shù)細(xì)胞啊?細(xì)胞計(jì)數(shù)到底有哪些作用呢?實(shí)際上，在我們想知道細(xì)胞生長(zhǎng)狀況時(shí)，除開立即觀查細(xì)胞形狀之外，制作細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖、測(cè)算細(xì)胞增長(zhǎng)時(shí)長(zhǎng)當(dāng)然就是廣泛采用的評(píng)價(jià)指標(biāo)體系了。
所以雖然應(yīng)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板手工制作計(jì)數(shù)細(xì)胞全過程十分繁雜，對(duì)試驗(yàn)者操作者規(guī)定也非常嚴(yán)格，現(xiàn)在都已經(jīng)有許多自動(dòng)化細(xì)胞計(jì)數(shù)器/儀，但是對(duì)于科研中所遇到的細(xì)胞來講，手工制作計(jì)數(shù)依然是很簡(jiǎn)單易行的辦法所以被眾多試驗(yàn)室選用。
