1．觀察步驟及儀器操作 根據實驗要求制備樣品完畢后。即可進行觀察。基本步驟如下：
(1)開啟儀器電源及光源：一般先開啟顯微鏡和激光器，再啟動計算機，然后啟動操作軟件，設置熒光樣品的激發光波長，選擇相應的濾光鏡組塊。以便光電倍增管(photo multiplier tube，PMT)檢測器能得到足夠的信號結果。使用汞燈的注意事項同普通熒光顯微鏡。
(2)設置相應的掃描方式：在目視模式下．調整所用物鏡放大倍數，在熒光顯微鏡下找到需要檢測的細胞。切換到掃描模式，調整雙孔針和激光強度參數，即可得到清晰的共聚焦圖像。
(3)獲取圖像：選擇合適的圖像分辨率，將樣品完整掃描后，保存圖像結果即可。
(4)關閉儀器：儀器測定樣品結束后，先關閉激光器部分，計算機仍可繼續進行圖像和數據處理。若要退出整個激光掃描共聚焦顯微鏡系統．則應該在激光器關閉后，待其冷卻至少10分鐘后再關閉計算機及總開關。
2．獲取三維圖像 激光掃描共聚焦顯微鏡具有細胞“CT”功能，因此，它可以在不損傷細胞的情況下，獲得一系列光學切片圖像。選用“Z-Stack"模式，即可實現此項功能 
。其基本步驟是：
①開啟“Z-Stack”選項；
②確定光學切片的位置及層數；
③啟動“Start”，獲得三維圖像。
3．獲取時間序列圖像 共聚焦顯微鏡的"Time-Series"功能，可以自動在實驗者規定的時間內按照設定的時間間隔獲取圖像。只需設定所需的時間間隔以及所需圖像數量，開啟“Start T”功能鍵，即可進行實驗。“Time-Series"功能大大減輕了實驗者的勞動強度，對于熒光漂白恢復和鈣離子成像等實驗非常實用。
