光學(xué)顯微鏡的觀察方式中，熒光觀察是一種重要且廣泛應(yīng)用的技術(shù)。以下是對熒光觀察方式的詳細(xì)介紹：
一、熒光現(xiàn)象
熒光是一種光致發(fā)光現(xiàn)象，指的是某些分子在吸收特定波長的光線（激發(fā)光）后，能夠再發(fā)射出其他波長的光線（發(fā)射光）。這種分子被稱為熒光團(tuán)，其激發(fā)光譜和發(fā)射光譜之間存在差值，發(fā)射光能量比激發(fā)光低，波長比激發(fā)光長，這個差值稱為“斯托克斯位移”。熒光現(xiàn)象包括自發(fā)熒光與繼發(fā)熒光兩種：
自發(fā)熒光：是指樣品自帶熒光團(tuán)，經(jīng)照射后就能發(fā)出熒光，如葉綠體。
繼發(fā)熒光：也稱二次熒光，樣品經(jīng)照射后不能發(fā)出熒光，需先用熒光染料標(biāo)記處理，再經(jīng)照射才能發(fā)生熒光。熒光顯微鏡主要利用的是繼發(fā)熒光。
二、成像原理
某些分子能吸收特定波長的光線，然后再發(fā)射出更長波長的光線。光譜波長從短到長，顏色分別是“紫外-紫-藍(lán)-綠-黃/橙-紅-紅外”，短波長激發(fā)可以激發(fā)長波長發(fā)射，比如紫外激發(fā)藍(lán)色發(fā)射，藍(lán)光激發(fā)綠色發(fā)射。在熒光顯微鏡中，通常使用熒光染料或轉(zhuǎn)染技術(shù)，將熒光團(tuán)結(jié)合到目標(biāo)組織或細(xì)胞器等結(jié)構(gòu)上，再用熒光顯微鏡激發(fā)觀察，從而實(shí)現(xiàn)高特異性、高靈敏度觀察。
三、熒光顯微鏡的關(guān)鍵部件
熒光顯微鏡是利用熒光特性進(jìn)行觀察、成像的光學(xué)顯微鏡，其構(gòu)造主要包括以下幾個關(guān)鍵部件：
熒光光源：用于提供熒光激發(fā)光，核心規(guī)格是光譜特征波長，要求能覆蓋染料的激發(fā)特征波長，并提供足夠光強(qiáng)。常用的熒光光源有汞燈、氙燈、金屬鹵素?zé)粢约癓ED熒光光源。其中，LED熒光光源在開關(guān)性能、使用壽命、光強(qiáng)可控性和免維護(hù)等方面具有顯著優(yōu)勢。
熒光激發(fā)塊：一組激發(fā)塊由激發(fā)濾光片、發(fā)射濾光片和二向分光鏡組成。激發(fā)濾光片只讓特定波長激發(fā)光通過，用以激發(fā)特定熒光染料；發(fā)射濾光片匹配熒光染料特性，只讓特定波長的發(fā)射熒光通過；二向分光鏡反射激發(fā)波段的光，透過發(fā)射波段的光。激發(fā)塊的作用是篩選特定的激發(fā)光和發(fā)射光，透過目標(biāo)熒光信號。其核心規(guī)格是光譜波長參數(shù)，其波長參數(shù)與熒光染料匹配度會極大影響熒光觀察效果，匹配不佳會帶來更多背景雜訊、更低的信噪比。
熒光臂/熒光模塊：用來安裝熒光光源和激發(fā)塊的載體，核心規(guī)格是通道數(shù)和光源接口，影響配件適配和擴(kuò)展性。此外，熒光顯微鏡還可能配備有外置快速轉(zhuǎn)輪等部件，以實(shí)現(xiàn)高速多色實(shí)驗(yàn)。
四、熒光觀察的成像特點(diǎn)
熒光觀察成像特征是暗背景和熒光色的目標(biāo)信號，這帶來了以下應(yīng)用優(yōu)勢：
高特異性和高靈敏度：可以特異性標(biāo)記微小的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、分子、基因、蛋白、化合藥物等。
多通道檢測：可標(biāo)記多種染料用于指示不同部位實(shí)現(xiàn)多通道成像，適合研究復(fù)雜生物系統(tǒng)的相互作用。
適用范圍廣：可實(shí)現(xiàn)活體、離體、標(biāo)記、自發(fā)等多種方式的熒光成像，對樣本限制較少。
五、熒光觀察方式的主要應(yīng)用
熒光顯微鏡廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、植物學(xué)、微生物學(xué)、病理學(xué)、遺傳學(xué)以及醫(yī)療診斷、產(chǎn)業(yè)應(yīng)用等領(lǐng)域。
生物學(xué)研究：借助熒光染料標(biāo)記，熒光顯微鏡可準(zhǔn)確而詳細(xì)地識別細(xì)胞和亞微觀細(xì)胞成分和活動，如細(xì)胞和亞微觀細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞生理、動物生理病理等。
醫(yī)療診斷：熒光顯微鏡可用于原位熒光雜交技術(shù)（FISH）檢測癌癥、呼吸道病毒檢測、真菌鏡檢等。
產(chǎn)業(yè)應(yīng)用：在材料科學(xué)領(lǐng)域，熒光顯微鏡可用于檢測礦物、紡織、紙張等材料的成分；在藥品檢測方面也有重要應(yīng)用。
綜上所述，熒光觀察方式作為光學(xué)顯微鏡的一種重要觀察手段，具有廣泛的應(yīng)用前景和重要的研究價值。
